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      定位重塑型納米凝膠介導共遞送抗血管藥物和自噬抑制劑實現對腫瘤的協同治療

      發布日期: 2021-01-29
      瀏覽人氣: 359

       腫瘤是一種復雜難治的疾病,對人類健康存在重大威脅。當腫瘤體積超過2-3mm3時,腫瘤的增殖、轉移與擴散主要依靠自身的血管系統來提供必要的氧氣和營養物質。而在缺乏血管的情況下,腫瘤具有自限性生長的特點。因此,將腫瘤血管作為靶點,抑制它的形成或破壞其存在,直接切斷腫瘤增殖與轉移的營養通道,是一個有吸引力的治療策略。

      目前,根據作用機制的不同,血管靶向藥物(VTAs)主要包括兩大類:血管生成抑制劑(AIs)和血管阻斷劑(VDAs)。在VDAs中,康普瑞?。–A4)作為常用的小分子血管阻斷劑,具有良好的抗血管活性,但其水溶性較差,難以通過血管給藥。所以,利用納米技術開發合適的遞藥體系可以有效改善CA4小分子藥物的缺陷,為其臨床應用提供一個新策略。

      納米凝膠具有良好的水分散性、優異的生理穩定性和結構可塑性。其中常作為藥用輔料的海藻酸鈉(Alg)因具有良好的生物相容性、可生物降解、廉價無毒以及易于凝膠化等優點受到大的關注。研究發現,Alg可以通過與多種過渡金屬陽離子交聯形成“蛋-盒”型螺旋水凝膠。Fe3+可與Alg交聯形成穩定的水凝膠,但當Fe3+經可見光或抗壞血酸等光電化學還原為Fe2+后,Fe2+與Alg的交聯能力迅速減弱,導致水凝膠自外而內進行解離,然后溶解。腫瘤微環境(TME)可作為鐵離子發生氧化態轉換的誘導劑,實現藥物在腫瘤的定點釋放。

      基于上述背景,鄭州大學藥物研究院張慧娟課題組*設計了一種定位重塑型納米凝膠CA4-FeAlg/HCQ。在CA4-FeAlg/HCQ納米凝膠到達腫瘤部位后,首先在腫瘤血管釋放CA4,阻斷外源性營養和氧氣供應,導致腫瘤細胞壞死。隨后FeAlg/HCQ分解成小納米粒穿透到腫瘤組織深部,Fe3+在低pH、高GSH條件下還原為Fe2+,納米凝膠自外而內快速解離,HCQ持續釋放。此外,Fe2+可與瘤內H2O2發生芬頓反應,產生強細胞毒性的•OH,進一步增強抗腫瘤作用。該研究為利用納米載體系統提高瘤內藥物遞送效率提供了一種有效的遞送策略,并為增強抗腫瘤免疫應答提高腫瘤治療效果提供了一種有意義的探索。

      圖1

       

       

       

       
       
       

      基本信息

      題目:

      Positioning Remodeling Nanogels Mediated Codelivery of Antivascular Drug and Autophagy Inhibitor for Cooperative Tumor Therapy

      期刊:ACS Applied Materials & Interfaces

      影響因子:8.758

      PMID: 31951366 

      作者:張紅嶺副教授

      通訊作者:張慧娟教授

      作者單位:鄭州大學藥物研究院

      索萊寶合作產品:

      產品名稱

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      Combretastatin A4 康普瑞汀

      IC1440

      Earle's Balanced Salt Solution EBSS

      H2045

      The micro H2O2 assay kit 

      過氧化氫(H2O2)含量檢測試劑盒

      BC3590

       

      摘 要

      腫瘤血管系統和增強的自噬共同為腫瘤的生長、增殖與轉移供應營養物質。阻斷外界營養供給,實現腫瘤饑餓治療,將是一種有前途的抗腫瘤方法。本研究中,作者構建了一種具有定位重塑功能的智能納米凝膠CA4-FeAlg/HCQ,可以殺死A549癌細胞。CA4-FeAlg/HCQ納米凝膠在血液循環中穩定存在,當它們到達腫瘤血管環境時,首先釋放血管阻斷劑康普瑞?。–A4),發揮抗血管作用。此后,FeAlg/HCQ解體為小納米凝膠(<30nm),有利于向腫瘤組織的深部滲透。進入腫瘤細胞后,FeAlg/HCQ納米凝膠將發生相重構(凝膠→溶膠),從而快速釋放出自噬抑制劑羥氯喹(HCQ)。CA4-FeAlg納米凝膠誘導的自噬可被HCQ有效抑制,從而實現抗血管與自噬抑制協同治療腫瘤的目的?;钚匝踅Y果顯示,在腫瘤微環境下,FeAlg中的Fe3+還原為Fe2+后,可以通過芬頓反應有效產生•OH,進一步殺死腫瘤細胞。藥效學實驗顯示,CA4-FeAlg/HCQ的體內治療效果佳,相對腫瘤體積終可下降至0.40±0.10。本研究將為藥物的共遞送和聯合應用提供一個有前景的策略。

       

      研究結果

       
       
       

      1.CA4-FeAlg/HCQ納米顆粒的制備與表征

      CA4-FeAlg/HCQ的制備過程如圖1A所示。按圖2A步驟合成Alg-CA4偶聯物,圖2B表明CA4成功連接到Alg分子上。CA4是通過新的酯鍵合成,成功接至Alg骨架上(圖2C)。制備的Alg-CA4可通過核磁共振氫譜進一步研究其化學結構(圖2D)。TEM直觀顯示CA4-FeAlg納米凝膠的形態為類球形,尺寸分布相對均勻(圖2E、F)。CA4-FeAlg平均水合粒徑約為150nm(圖2G)。以Fe3+為交聯劑合成的CA4-FeAlg平均電位值從-21.9mV變為9.23mV(圖2H)。

      選擇自噬抑制劑HCQ作為聯用藥物協同治療腫瘤。將CA4-FeAlg凍干粉在HCQ溶液中緩慢溶脹,更多的HCQ分子隨著水分子進入納米凝膠網絡中。如圖2I所示,投藥比為1:2是優制備條件。CA4-FeAlg/HCQ納米凝膠的粒徑分布范圍依然較窄,終水合粒徑為165nm(圖2J)。在進一步載藥后,CA4-FeAlg/HCQ的平均電位值也由9.23mV變為-13.1mV(圖3A)。

      圖2

      2.藥物釋放能力的評估

      研究者采用pH7.4+10%BSA溶液模擬血液生理環境。在這種介質溶液中,48h內只有17%的CA4從CA4-FeAlg中釋放出來(圖3B)。此外由釋放曲線可知,CA4的釋放具有pH依賴性(圖3B)。與在pH5.5介質溶液中相比,置于pH7.4介質溶液中(模擬腫瘤血管環境)的CA4釋放速率更快,其累積釋藥百分率在12h內甚至達到92.12%(圖3C)。CA4釋放后的納米凝膠仍保留原始結構(圖3D),與直接合成的FeAlg結構并無明顯差異(圖3E)。這一結果說明,CA4-FeAlg納米凝膠在血液循環過程中可以穩定存在,而在腫瘤血管處CA4可以快速釋放出來。

      接下來,用同樣的方法評估了HCQ在CA4-FeAlg/HCQ體系中的釋放特性(圖3F)。從圖3F可以看出,HCQ在有GSH存在的介質中釋放速度明顯加快。這一現象歸因于在GSH的還原條件下,納米凝膠中的Fe3+被還原為Fe2+,Fe2+與Alg的親和作用降低,納米凝膠自外而內進行解離,從而實現HCQ的有效釋放。在弱酸性環境中(pH5.5+5mM GSH,模擬腫瘤細胞)這種現象表現更明顯,24h時HCQ的累積釋藥率可達到95.07%,而pH7.4+10%BSA介質中HCQ釋放較慢。以上結果表明,CA4-FeAlg/HCQ遞藥體系在血液和正常組織中能夠保持相對穩定,而蓄積到腫瘤部位后CA4和HCQ可在各個靶向位點連續釋放。

      圖3

      3.細胞攝取和溶酶體共定位

      如圖4A所示,FeAlg納米凝膠可被A549細胞高效攝取,實現藥物的有效遞送。為了進一步探索FeAlg在細胞內的分布,利用LSCM對納米凝膠與細胞器的共定位現象進行了可視化研究。如圖4B所示,由于游離FITC無法進入A549細胞,視野中未發現綠色熒光,FeAlg/FITC組在共孵育0.5h時,胞質內首先觀測到微弱的綠色熒光,熒光灰度值顯示FeAlg與溶酶體的平均共定位系數為0.15±0.03。隨著培養時間的推移,細胞中的綠色熒光也在一直不斷增多并且逐漸聚集于溶酶體,在1h和3h時,平均共定位系數分別增加到0.49±0.07和0.74±0.09。以上結果顯示溶酶體可能成為FeAlg/HCQ納米凝膠遞藥系統發揮抗腫瘤作用的有效靶點。

      圖4

      4.溶酶體損傷與自噬抑制

      當納米凝膠被腫瘤細胞攝取并蓄積在溶酶體內后,Fe3+在高GSH作用下轉化為Fe2+,在這種特殊的微環境中Fe2+又可與瘤內H2O2引起“芬頓”反應生成•OH(圖5A),導致溶酶體破裂,從而使自噬溶酶體的形成及降解受到嚴重阻礙。藥物處理6h后,細胞內pH變化趨勢如圖5B所示。與空白組相比,HCQ和CA4-FeAlg/HCQ組的熒光信號明顯增強,表明細胞內pH值顯著升高。

      為了研究•OH和pH值變化對溶酶體穩定性的影響,用LSCM記錄溶酶體的變化情況。如圖5C和圖5D所示,空白對照組中所有細胞的溶酶體形態完整,聯合•OH和pH升高對溶酶體的破壞效應,CA4-FeAlg/HCQ處理組中平均熒光密度驟降至25.44,僅為對照組的2.28%。由此表明,FeAlg和HCQ可以共同作用于溶酶體。

      接下來,作者研究了CA4-FeAlg/HCQ在缺乏營養時,對腫瘤細胞自噬水平的影響。圖5E顯示,與DMEM組相比,在EBSS組中出現了顯著的LC3蛋白的陽性自噬體。HCQ和CA4-FeAlg/HCQ處理后,細胞內的LC3蛋白表達均顯著增加。這是因為營養缺乏誘導細胞自噬后,•OH引起的溶酶體膜的不穩定和HCQ引起的溶酶體酸性環境的破壞可以協同抑制自噬小體的降解,導致大量自噬體的積累。LC3-II:LC3-I值也為證明CA4-FeAlg/HCQ通過抑制自噬引起自噬體累積提供了依據。以上結果表明,CA4-FeAlg/HCQ在無營養情況下能有效抑制腫瘤細胞自噬。

      圖5

      5.體外腫瘤深部滲透與細胞毒性

      通過體外模擬TME,研究CA4-FeAlg納米凝膠的形態變化。在pH6.5,20μM GSH的介質中,CA4-FeAlg已經明顯解體為小納米凝膠,水合粒徑減小為27nm左右(圖6A)。而當酸性變強,GSH濃度增加后,CA4-FeAlg納米凝膠自外向內解離,發生了相重構,大多數納米凝膠的粒徑變得更小甚至溶解(圖6B)。這是因為FeAlg納米凝膠的交聯劑Fe3+可以被GSH迅速還原為Fe2+。Fe2+與Alg的相互作用較弱導致FeAlg結構從外向內解離。

      研究者利用3DMCS模型考察體外深部滲透效果。如圖6C表明SiO2納米粒子很難擴散到腫瘤深部。而在80μm深度時,FeAlg/FITC組中有強烈的綠色熒光分布在腫瘤球的中央區域。120μm深度時,FeAlg/FITC+10mM GSH組中有更多的綠色熒光分布于腫瘤球的中央范圍內,其相對熒光強度是SiO2/FITC組的12倍。圖6D顯示,FeAlg/FITC+10mM GSH組的相對熒光強度均高于其他兩組。以上結果表明FeAlg納米凝膠分裂成小的納米顆粒后,利于實現腫瘤的深部滲透。

      圖6

      CA4-FeAlg和CA4-FeAlg/HCQ的細胞毒性明顯集中,呈一定的時間依賴性(圖6E和F)。選擇CA4前藥CA4P作為陽性對照組。CA4-FeAlg組的細胞抑制率均明顯高于CA4P組,表明CA4-FeAlg納米凝膠可作為CA4前藥用于腫瘤治療。此外,如圖6F所示,CA4-FeAlg/HCQ對A549細胞的毒性強。當藥物濃度為20μg/mL,作用時間為48h時,CA4-FeAlg/HCQ組的細胞抑制率甚至達到93.86±4.78%。此外,觀察CA4-FeAlg/HCQ組的活細胞數(綠色)少(圖6G)?;谝陨辖Y果,CA4-FeAlg/HCQ可在體外有效殺傷A549腫瘤細胞。

      6.體內腫瘤的靶向性與穿透性

      如圖7A所示,游離的IR783廣泛分布于裸鼠體內,并在體內被迅速清除。隨著時間的延長,腫瘤內的熒光信號大幅度減弱。而FeAlg/IR783和CA4-FeAlg/IR783組腫瘤區域的熒光信號都在逐漸增加,在8h時達到高。隨后,FeAlg/IR783組腫瘤內的熒光強度迅速下降,24h時僅存在微弱熒光。然而,CA4-FeAlg/IR783在24h仍有較強的熒光。體外成像結果(圖7B)顯示游離IR783主要在肝、腎組織內分布,FeAlg/IR783主要存在于肝組織,腎、肺和腫瘤組織中也有少量分布。CA4-FeAlg/IR783主要存在于腫瘤組織,這歸因于CA4與β-微管蛋白上的秋水仙堿受體結合。以上結果進一步證明CA4-FeAlg/IR783具有優異的腫瘤靶向性,有助于藥物在腫瘤部位大量蓄積。

      作者研究了CA4-FeAlg/HCQ在腫瘤組織內的深部穿透性能。如圖7C和7D所示,粒徑穩定的SiO2/FITC腫瘤組織穿透性較差,主要分布在腫瘤血管周圍。然而,FeAlg/FITC組中的穿透距離顯著增大。上述結果均表明CA4-FeAlg可以將治療藥物高效遞送至腫瘤部位,并均勻滲透到實體瘤組織中。

      圖7

      7.體內抗腫瘤效果和安全性評價

      為了系統性評價CA4-FeAlg/HCQ的抗癌性能,作者研究了CA4-FeAlg/HCQ在A549荷瘤裸鼠體內的抗腫瘤作用。如圖7E所示,N.S.組的相對腫瘤體積一直在升高,終達到1.96±0.17。CA4P對腫瘤生長有一定程度的抑制作用,但腫瘤體積波動較大。相比之下,CA4-FeAlg能夠顯著抑制A549腫瘤的生長,揭示CA4-FeAlg作為新型的CA4前藥具有良好的抗腫瘤效果。CA4-FeAlg/HCQ的治療效果佳,治療終點時的腫瘤體積?。▓D7F)。CA4-FeAlg/HCQ的佳抗腫瘤作用可能來源于以下三個機制:其一,CA4破壞腫瘤血管系統切斷外源性營養供應,腫瘤細胞發生壞死;其二,FeAlg通過響應TEM生成ROS產生細胞毒性;其三,CA4誘導的自噬被HCQ抑制,阻斷腫瘤細胞的內源性營養通道。接下來,研究者逐一驗證了這些可能的機制。

      如圖8A所示,N.S.組中的腫瘤血管相對完整、豐富。然而,CA4P組中的腫瘤血管密度明顯降低。在CA4-FeAlg組,腫瘤血管數量少,細胞之間的空隙也變大。接下來,作者對腫瘤細胞內的•OH含量進行了測定。實驗結果表明(圖8B),FeAlg給藥組的腫瘤細胞中•OH含量明顯增加,熒光強度是N.S.組的3.58倍。由此表明,FeAlg在腫瘤細胞中可以通過芬頓反應高效快速的產生大量•OH。研究者采用免疫組化與TEM表征對CA4-FeAlg/HCQ抑制腫瘤細胞自噬的情況進行考察。如圖8C所示,與N.S.和CA4-FeAlg組相比,HCQ和CA4-FeAlg/HCQ組自噬相關蛋白LC3表達明顯升高,其中以CA4-FeAlg/HCQ組表達水平高。此外,TEM結果(圖8D)也證明,經CA4-FeAlg/HCQ處理后的腫瘤細胞中顯著存在大量累積的自噬泡(黃色箭頭指示)。這再次提示CA4-FeAlg抗血管治療誘導的自噬可被HCQ有效抑制,從而實現抗血管與自噬抑制協同治療腫瘤的目的。

      研究者記錄了治療期間荷瘤小鼠的體重。如圖8E所示,各組之間的荷瘤鼠體重沒有發生急劇下降的現象,治療期間的變化趨勢基本相同,沒有顯著性差異,說明CA4-FeAlg/HCQ納米凝膠相對安全,毒副作用較小。各組心、肝、脾、肺、腎、腦組織均無明顯病理改變,進一步證明了CA4-FeAlg/HCQ的生物安全性。

      圖8

       

      研究結論

       

      綜上所述,研究者成功構建了定位重塑型納米凝膠(CA4-FeAlg/HCQ),用于共遞送血管阻斷劑CA4與自噬抑制劑HCQ,實現了CA4和HCQ在腫瘤血管和腫瘤細胞中的連續釋放,以及對A549非小細胞肺癌的協同治療。另外,FeAlg可催化瘤內H2O2產生強細胞毒性的•OH,進一步增強抗腫瘤作用。該系統將為藥物的共遞送和聯合應用提供了一個有前景的策略。

       

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