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      教你成為平淡無奇的WB實驗小能手—樣本制備篇

      發布日期: 2021-01-29
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       WB實驗流程

       

       

       

      樣本制備的步驟

       

       

      關于樣本采集和保存,蛋白提取的相關

      知識和技巧請查看:

       

      接下來,讓小編帶您總結關于蛋白定量和蛋白變性相關的知識點:

       

      蛋白定量

      測定蛋白常用的方法有Bicinchoninic acid (BCA)法、Lowry法Bradford法(考染法)

       
       

      1. BCA法的測定原理是蛋白質將銅離子還原成亞銅離子,后者在堿性溶液中與BCA結合生成紫紅色結合物,該復合物在562nm處有吸光值且與蛋白質濃度成正相關性,據此可測定蛋白質濃度??捡R斯亮藍在游離狀態下呈紅色,大光吸收在488nm;當它與蛋白質結合后變為青色,蛋白質—色素結合物在595nm波長下有大光吸收。其光吸收值與蛋白質含量成正比,因此可用于蛋白質的定量測定。

       
       

       

       
       

      2. Lowry法又稱為Folin-酚試劑法,首先在堿性溶液中形成銅-蛋白復合物,然后這一復合物還原磷鉬酸-磷鎢酸試劑(Folin-酚上級),產生鉬藍和鎢藍復合物的深藍色,這種深藍色的復合物在745~750nm處有大的吸收峰,顏色的深淺(吸收值)與蛋白質濃度成正比,可根據750nm的光吸收值大小計算蛋白質的含量。

       
       

       

       
       

      3. Bradford法又稱為考染法。染料結合法測定蛋白質的優點是靈敏度較高,可檢測到微量蛋白,操作簡便,試劑配制極簡單,重復性好,但干擾因素多??捡R氏亮藍G-250具有紅色和青色兩種色調、在酸性溶液中游離狀度下為棕紅色,當它通過疏水作用與蛋白質結合后,變成藍色,大吸收波長從465nm轉移到595nm處,在一定的范圍內,蛋白質含量與595nm的吸光度成正比,測定595nm處光密度值的增加即可進行蛋白質的定量。

       
       

       

      三者之中,Lowry法與BCA同屬化學法,Lowry法是藥典中使用的蛋白濃度測定方法,但是操作繁瑣,實驗時間長。BCA法操作簡單,時間短,形成的顏色復合物穩定性強,但可能受一些雜質影響。Bradford屬于染料結合法,也易受到去垢劑影響。

       

      蛋白變性

      蛋白變性常用方式是高溫煮樣,煮樣條件設置為100℃,根據樣品量的多少,設置時間5~15min,煮樣時間過長,一些蛋白可能會產生聚集性沉淀。疏水性極強的蛋白質,如含有多個跨膜結構域的蛋白質,在煮沸時可能會發生聚集或寡聚化,因此,其煮樣條件為40℃~55℃條件下,溫浴10~60min變性。煮樣后的樣本于-20℃或-80℃保存。

      提取并定量后,并未加Loading Buffer煮樣的蛋白樣品,保存于-80℃時,防止反復凍融,并盡量于1周內加Loading Buffer煮樣處理,不要超過2周。

       

      在此,為了幫您更好地完成實驗,我們推薦索萊寶蛋白定量和蛋白變性相關的配套產品。

      產品名稱

      產品貨號

      Bradford法蛋白濃度測定試劑盒

      PC0010

      BCA蛋白濃度測定試劑盒

      PC0020

      Lowry法蛋白濃度測定試劑盒

      PC0030

      4×蛋白上樣緩沖液

      (含DTT)

      P1015

      4×蛋白上樣緩沖液

      (含巰基還原劑)

      P1016

      4×非變性蛋白上樣緩沖液

      P1017

       

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